Identifizierung von Δ

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 997 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Hyperprolinämie Typ II (HPII) ist ein angeborener Stoffwechselfehler aufgrund genetischer Varianten in ALDH4A1, der zu einem Mangel an Δ-1-Pyrrolin-5-carboxylat (P5C)-Dehydrogenase führt. Dies führt zu einer Anhäufung toxischer Konzentrationen von P5C, einem Zwischenprodukt im Prolin-Katabolismus. Das sich ansammelnde P5C reagiert spontan mit Pyridoxal-5'-phosphat und inaktiviert es, einen entscheidenden Cofaktor für viele enzymatische Prozesse, von dem angenommen wird, dass er der pathophysiologische Mechanismus für HPII ist. Hier beschreiben wir die Verwendung einer Kombination aus ungezielter LC-QTOF-Metabolomik, NMR-Spektroskopie und Infrarot-Ionenspektroskopie (IRIS), um Biomarker für HPII zu identifizieren und zu charakterisieren, die aus der spontanen Reaktion von P5C mit Malonsäure und Acetessigsäure resultieren. Wir zeigen, dass diese Biomarker zwischen HPI, das durch einen Mangel an Prolinoxidase-Aktivität verursacht wird, und HPII unterscheiden können. Die Aufklärung ihrer molekularen Strukturen liefert Einblicke in die Pathophysiologie der HPII-Erkrankung.

Hyperprolinämie Typ II (HPII, OMIM 239510) ist eine seltene angeborene Stoffwechselstörung (IEM), deren biochemisches Hauptmerkmal die Anreicherung von Prolin in Körperflüssigkeiten ist. HPII wird durch einen Mangel an der ALDH4A1-kodierten Δ-1-Pyrrolin-5-Carboxylat-Dehydrogenase verursacht, dem Enzym, das für den zweiten Schritt des Prolinabbaus verantwortlich ist. Dieser Schritt beinhaltet die Umwandlung von L-Glutamat-5-semialdehyd, das im Gleichgewicht mit seinem zyklischen Gegenstück Δ-1-Pyrrolin-5-carboxylat (P5C) steht, zu Glutaminsäure (Abb. 1a)1,2. Klinisch ist HPII durch Krämpfe im Kindesalter gekennzeichnet, die durch eine gleichzeitige Infektion hervorgerufen werden können3. Es wurde vorgeschlagen, dass ein sekundärer Vitamin-B6-Mangel zu den Krämpfen beiträgt, da die Ansammlung von P5C die biologisch aktive Form von Vitamin B6, Pyridoxalphosphat (PLP), durch eine spontane Reaktion auf P5C-PLP inaktiviert (Abb. 1b)4,5. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass P5C mit Acetessigsäure reagiert, und basierend auf einer Analogie zur Reaktion von P5C mit PLP wurde die Hypothese aufgestellt, dass dies zur Bildung der Addukte 1–3 führt (Abb. 1c)6.

Ein Mangel an P5C-Dehydrogenase führt zur Akkumulation von P5C und Glutamat-5-Semialdehyd. b Die Reaktion von P5C mit PLP führt zu dessen Deaktivierung. c Zuvor vorgeschlagene Biomarker für HPII6. d Biomarker von P5C mit 1,3-Dicarbonylverbindungen wurden in dieser Studie identifiziert.

Analog dazu wird angenommen, dass die PLP-Inaktivierung der wichtigste pathophysiologische Mechanismus bei Pyridoxin-abhängiger Epilepsie (PDE-ALDH7A1; OMIM 266100) ist, einem IEM im Lysinstoffwechsel, der zu früh einsetzenden refraktären Anfällen führt, die durch die Verabreichung von Pyridoxin behandelt werden können . Bei diesem angeborenen Fehler des Lysin-Katabolismus reichert sich das zyklische Imin Δ-1-Pyrrolin-6-Carboxylat (P6C) an und reagiert über das nukleophile Enamin-Tautomer mit PLP, was zu einem PLP-Mangel führt7. Durch einen ungezielten Metabolomics-Ansatz (Next Generation Metabolic Screening, NGMS)8 hat unser Team kürzlich Biomarker für PDE-ALDH7A1 identifiziert. Diese Biomarker sind das Ergebnis der Reaktion von P6C mit Acetessigsäure oder Malonsäure9,10. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zwischen den zyklischen Iminen P6C und P5C nahmen wir an, dass dieser Mechanismus der Adduktbildung auch bei der Reaktion von P5C auftreten würde, was zur Bildung von (2 R)-5-(2-Oxopropyl)pyrrolidin-2 führen würde -Carbonsäure (2-OPC, 4) und (2 R)-5-(Carboxymethyl)pyrrolidin-2-carbonsäure (CPC, 5) (Abb. 1d) und dass die zuvor vorgeschlagenen Strukturen des Reaktionsprodukts von P5C mit Acetessigsäure, Biomarker 1-2 (Abb. 1c), wurden in früheren Studien wahrscheinlich falsch zugeordnet6.

Mithilfe unseres zuvor etablierten Ansatzes, der ungezielte Metabolomik mit Infrarot-Ionenspektroskopie (IRIS) und der Synthese von Referenzstandards kombiniert, zeigen wir hier, dass P5C mit Acetessigsäure oder Malonsäure auf analoge Weise reagiert, wie wir zuvor für P6C9 aufgeklärt haben, was zur Bildung von führt Biomarker 2-OPC (4) bzw. CPC (5) (Abb. 1d). Diese Ergebnisse bestätigen weiterhin eine allgemeine biochemische Reaktion zwischen zyklischen Iminosäuren und 1,3-Dicarbonylverbindungen. Darüber hinaus haben die identifizierten Metaboliten das Potenzial, als Biomarker für die Diagnose von HPII eingesetzt zu werden und Einblicke in die Pathophysiologie dieser Krankheit zu geben.

Eine gezielte Metabolomik von Plasmaproben von drei HPII-Patienten aus zwei unabhängigen Familien zeigte deutlich erhöhte Merkmale im Vergleich zu Kontrollen. Neben den bekannten Biomarkern für HPII, Prolin, 2-Pyrroloylglycin und Pyrrol-2-carbonsäure11,12,13 wurden drei weitere Merkmale identifiziert (Tabelle 1). Genauer gesagt waren zwei Merkmale, A und B, beide mit einem Masse-Ladungs-Verhältnis (m/z) von 170,0823 (Retentionszeit 1,16 bzw. 1,19 min), in Flüssigkeiten von HPII-Patienten im Vergleich zu Kontrollen signifikant erhöht; Diese Biomarker werden auch im Urin und Plasma von Patienten in Ketose beobachtet (Abbildung S1). Außerdem wurde festgestellt, dass Merkmal C mit m/z 172,0615 (Retentionszeit jeweils 0,82 min) in allen HPII-Patientenproben erhöht war, wenn auch in geringerem Maße. Wir stellen fest, dass bei keinem dieser Merkmale ein Konzentrationsanstieg in der Plasmaprobe eines HPI-Patienten festgestellt wurde (SI-Abb. S1, S2 und S3) und die Differenzierung von HPI und HPII möglich war. Die Annotation der bekannten Merkmale Prolin, Hydroxyprolin, 2-Pyrroloylglycin und Pyrrol-2-carbonsäure basierend auf der Erkennung ihres m/z im LCMS (SI-Abb. S4–S7) wurde auf der Grundlage der Human Metabolome Database durchgeführt (HMDB) nach einem bioinformatischen Protokoll, das zuvor von Coene et al.10 beschrieben wurde.

Die Charakterisierung der anderen erkannten Merkmale wurde zunächst unter Verwendung von kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) MS/MS im positiven Modus versucht. Für die Merkmale A und B entsprach das Primärfragment dem neutralen Verlust von C3H6O (Δm = 2,6 ppm), was zu einem Fragment mit m/z 114,0547 führte, das nach neutralen Verlusten von H2O weiter auf m/z 96,044 und m/z 68,049 fragmentierte (Δm = 3,1 ppm) bzw. CO + H2O (Δm = 4,4 ppm) (Abb. 2a). Es wurde eine ähnliche Fragmentierung von Merkmal C auf m/z 114,0550 gefunden, was auf einen neutralen Verlust von C2H4O2 (Δm = 3,5 ppm) hinweist, mit sekundärer Fragmentierung sowohl auf m/z 96,0443 (Δm = 1,0 ppm) als auch auf m/z 68,0495 (Δm =). 4,4 ppm). Einzigartig für Biomarker C ist die Fragmentierung auf m/z 128,0703, 110,0598 und 82,0650, was einem neutralen Verlust von CO2 + H2 (Δm = 2,3), CO2 + H2O + H2 (Δm = 1,8) und 2CO2 + 2H2 ( Δm = 1,2) bzw. (Abb. 2b). Von besonderem Interesse ist das Fragment mit m/z 114,055 in beiden Spektren, das der Masse von [P5C + H]+ (Δm = 3,5 ppm), dem akkumulierenden Metaboliten von HPII, entspricht.

a CID MS/MS-Spektren von Merkmal A (m/z 172,0964). b CID MS/MS-Spektren von Merkmal C (m/z 174,0765).

Ein ähnliches Fragmentierungsmuster wurde für die zuvor annotierten P6C-Analoga beobachtet9,10, nämlich der neutrale Verlust von C3H6O für Merkmal A und B und C2H4O2 für Merkmal C. Wir vermuteten daher eine ähnliche Struktur und Konnektivität dieser Fragmente zum P5C- Kern, der zu den vorgeschlagenen Strukturen von 2-OPC (4) und CPC (5) führt (Abb. 1d).

Um die Merkmale A und B zu identifizieren, wurden sie mithilfe von IRIS weiter charakterisiert. Diese Technik ermöglicht die Aufzeichnung von IR-Spektren massenisolierter Ionen in einem Massenspektrometer und liefert sensible Informationen über die genaue Molekülstruktur des Ions. Durch den Vergleich mit quantenchemisch vorhergesagten IR-Spektren von Kandidatenstrukturen ist eine erste Strukturaufklärung möglich. Es wurden IR-Spektren der massenisolierten protonierten Ionen (m/z 172,0968) der Merkmale A und B aufgezeichnet, die aus HPII-Urinproben mithilfe einer hydrophilen Interaktionsflüssigkeitschromatographie (HILIC)-Methode isoliert wurden, was zu einer Basislinientrennung der Merkmale führte, was möglich war kann mit der Umkehrphasenmethode, die für das ungezielte Screening verwendet wird, nicht erreicht werden. Abbildung 3 zeigt den Vergleich der experimentellen Spektren der Merkmale A und B (schwarze Spuren) mit den theoretischen Referenzspektren (orange gefüllte Spuren) und zeigt eine qualitative Ähnlichkeit, die auf die allgemeine chemische Struktur der Merkmale A und B hinweist.

Vergleich der experimentellen IR-Spektren von Merkmal A (schwarze Spur) und Referenzstandard 4cis (blaue Linie) mit dem theoretischen IR-Spektrum von 4cis (orange Spur), b Merkmal A (schwarze Spur) und Referenzstandard 4trans (blaue Linie) mit dem theoretischen IR-Spektrum von 4trans (orangefarbene Spur). In jedes Panel sind molekulare Strukturen eingearbeitet, die den protonierten Referenzstandards entsprechen.

Insbesondere die für Struktur 4 berechneten C=O-Streckschwingungen der Carbonylgruppen bei ~1710 und ~1750 cm−1 zeigen eine gute Überlappung mit den experimentell erhaltenen Spektren für Merkmal A und B. Für beide Merkmale gilt: Eine hervorragende Überlappung wird für die intensive C-OH-Streckung der Carbonsäure gefunden, die bei 1160 cm−1 vorhergesagt wird. Im Gegensatz dazu stimmt die berechnete Frequenz der NH2-Schwingung nicht gut mit den experimentell erhaltenen Spektren für die Merkmale A und B überein. Diese Diskrepanz kann auf das anharmonische Verhalten des NH-Biegemodus zurückgeführt werden, was zu einer Rotverschiebung der darin vorhergesagten Spektren führt die harmonische Näherung14,15, wie bereits für den entsprechenden P6C-Biomarker festgestellt9. Insgesamt wird der Spektralbereich zwischen 1200 und 1500 cm−1 durch die berechneten Spektren ausreichend vorhergesagt. Die Peakform in diesem Bereich, die die beiden Merkmale aufgrund der unterschiedlichen Stereochemie unterscheidet, wird in den berechneten Spektren gut reproduziert. Basierend auf diesem Unterschied in der Peakform weisen wir Merkmal A vorläufig als 4cis und B als 4trans zu

Um die Identität der Merkmale A und B zu bestätigen und zu beweisen, dass die vorgeschlagenen Strukturen aus der Reaktion von P5C mit 1,3-Dicarbonylverbindungen entstehen können, wurden die Referenzstandards synthetisiert. Das zyklische Imin P5C wurde mit den wahrscheinlichen Reaktionspartnern Acetessigsäure und Malonsäure in vitro unter physiologisch relevanten Bedingungen inkubiert. P5C wurde durch saures Entschützen von 8 hergestellt, das durch Reduktion von Lactam 7 mit Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL-H) erhalten wurde (Abb. 4a). Die Inkubation von P5C mit Acetessigsäure oder Malonsäure bei neutralem pH-Wert in wässrigen Medien führte zur Bildung einer Mischung, die das für die Biomarker AB (9) bzw. C (10) beobachtete Verhältnis von Masse zu Ladung enthielt. Zu Reinigungszwecken wurde die Mischung benzyliert, was zur Isolierung von 11 bzw. 12 führte. Die anschließende Hydrierung ermöglichte die Isolierung von 4 und 5, obwohl nur das cis-Stereoisomer von 4 mit akzeptabler Reinheit isoliert werden konnte (Abb. 4a). Um eine Mischung von Diastereoisomeren zu synthetisieren, wandten wir uns der N-Acyliminiumionen-Chemie zu. Die Addition des Methylketonfragments wurde durch Lewis-Säure-Aktivierung des N,O-Acetals 13 in Gegenwart des tert-Butyldimethylsilyl (TBDMS)-geschützten Enolethers von Aceton erreicht. Die resultierenden untrennbaren Diastereoisomere wurden mit TFA entschützt, um 4 als Diastereoisomerengemisch zu ergeben (Abb. 4b).

Die Biomarker 4–5 wurden über (a) eine Inkubation von Malonsäure oder Acetessigsäure mit P5C synthetisiert und b) die Mischung der Diastereoisomere von 4 wurde über N-Acyliminiumionen-Chemie synthetisiert.

IR-Spektren wurden für die protonierten Ionen beider (HILIC-getrennter) Diastereomere der synthetischen Referenzverbindung 4 aufgenommen. Ein Vergleich der IR-Spektren (Abb. 3, blaue Spuren) mit den gemessenen Merkmalen A und B (schwarze Spuren), ergab eine hervorragende spektrale Übereinstimmung. Die geringfügigen Abweichungen sind auf Schwankungen der experimentellen Bedingungen zwischen den Messungen, beispielsweise der Laserleistung, zurückzuführen. Die Kombination aus NMR-Charakterisierung der synthetisierten Standards und einer hervorragenden spektralen Übereinstimmung der synthetisierten Standards mit den Metaboliten im IRIS-Experiment bestätigt die Identität der Merkmale A und B. Vergleich der Retentionszeit und IRIS-Spektren der Biomarker bei Patienten mit den einzelnen isolierten Das Diastereoisomer 4cis ermöglichte es uns, die Stereochemie der Biomarker A und B eindeutig als 4cis bzw. 4trans zuzuordnen (SI-Abb. S8 und S9).

Biomarker C kommt in den Patientenproben seltener vor und wird darüber hinaus von der Standard-RPLC-Methode, die für ungezielte Screenings verwendet wird, nur schlecht zurückgehalten16. Darüber hinaus reichte die Empfindlichkeit der HILIC-Methode zur Trennung von Biomarker A und B nicht aus, um Biomarker C nachzuweisen. Dies verhinderte die Verwendung von IRIS zur Identifizierung von Biomarker C, und wir verlassen uns daher auf LC und MS/MS, um das aufzuklären Struktur von Merkmal C. CID sowohl des Referenzstandards als auch der massenselektierten Ionen von Merkmal C ergab das gleiche Fragmentierungsmuster (SI Abb. S10). Zusammen mit den IR-basierten Zuordnungen der Metaboliten A und B und dem analogen Reaktionsprodukt, das für PDE9,10 beobachtet wurde, ordnen wir Merkmal C dem Reaktionsprodukt von P5C mit Malonsäure als einer Mischung untrennbarer Diastereomere zu.

Die spontane Reaktion von P5C mit Acetessigsäure wurde zuvor von der Referenzstelle festgestellt. 6. In dieser Arbeit basierte die strukturelle Zuordnung der Metaboliten, die aus den Inkubationen von P5C mit Acetessigsäure resultierten, auf GC-MS/MS nach Ableitung des Reaktionsgemisches mit Trimethylsilan (TMS). Die Autoren schlagen eine resultierende Struktur der P5C-Reaktion mit Acetessigsäure vor und nach der Decarboxylierung vor, basierend auf einer Analogie zur Reaktion von P5C mit PLP (Abb. 5b), was zu den Strukturen 1-3 führt (Abb. 5a).

a Vorgeschlagene Molekülstruktur des ursprünglich nachgewiesenen Reaktionsprodukts von P5C mit Acetessigsäure6. b Zuvor charakterisiertes Addukt von P5C mit PLP. c In dieser Arbeit identifizierte Biomarker. d Entstehungsweg der nachgewiesenen Biomarker.

Hier identifizierten wir unter Verwendung von Referenzstandards, die sowohl durch NMR als auch durch IRIS charakterisiert wurden, die Strukturen 4 und 5 als HPII-assoziierte Metaboliten (Abb. 5c), die potenziellen diagnostischen Wert haben. Die Bildung dieser Biomarker erfolgt durch Addition von 1,3-Dicarbonylverbindungen an das sich ansammelnde zyklische Imin und anschließende Decarboxylierung (Abb. 5d). Die in dieser Studie für die Inkubation von P5C mit Acetessigsäure und seinem Carbonsäure enthaltenden Zwischenprodukt 15 identifizierten Strukturen haben die gleichen Molekülformeln wie die in Lit. vorgeschlagenen. 6. Darüber hinaus enthalten sie eine gleiche Anzahl nukleophiler Gruppen, die für die TMS-Derivatisierung zugänglich sind. Darüber hinaus fanden wir während der präparativen Synthese der Biomarker durch Inkubation von P5C mit 1,3-Dicarbonylverbindungen keine spektroskopischen Hinweise auf die Bildung der in Lit. vorgeschlagenen Strukturen. 6 (Abb. 5a). Wenn diese Strukturen gebildet würden, würden wir erwarten, eine einzigartige Abwärtsfeldverschiebung entsprechend dem Iminproton zu beobachten, wie sie für die Addukte von P5C mit PLP5 beobachtet wurde. Für die Reaktionsprodukte mit Acetessigsäure haben wir solche Hinweise nicht beobachtet. Zusammengenommen ist es wahrscheinlich, dass wir die gleichen Addukte von Acetessigsäure und P5C entdeckt haben, wie in Lit. beschrieben. 6. haben aber jetzt die molekulare Struktur korrekt annotiert (Abb. 5c). Darüber hinaus weist die Bildung des Addukts von Malonsäure mit P5C (Abb. 5c, 5) auf eine allgemeine Reaktivität des zyklischen Imins P5C mit anderen biochemisch relevanten 1,3-Dicarbonylverbindungen hin. Darüber hinaus ist 2-OPC (4) in den Körperflüssigkeiten ketotischer Patienten vorhanden, da die erhöhte Acetessigsäurekonzentration in ihrem Plasma und Urin spontan mit geringen Mengen P5C reagieren kann, was zur Bildung von 2-OPC (4) führt. Eine ähnliche spontane Reaktion wurde bei Patienten mit Pyridoxin-abhängiger Epilepsie beobachtet, bei denen P6C spontan mit der verfügbaren Acetessigsäure und Malonsäure reagiert 10.

Diese Metaboliten können auch einen Einfluss auf die Diagnose und Nachsorge von Patienten mit HPII haben. Durch die Einbeziehung von 2-OPC (4) und CPC (5) als Plasma-HPII-Biomarker in ein diagnostisches IEM-Screening-Panel können wir mithilfe unserer NGMS-Methodik problemlos zwischen verschiedenen Ursachen für Hyperprolinämie unterscheiden. Neben HPII ist Hyperprolinämie Typ I (HPI, OMIM 239500) auch eine genetische Erkrankung, die biochemisch durch die Anreicherung von Prolin in Körperflüssigkeiten gekennzeichnet ist. Da der Enzymmangel bei HPI jedoch einen Schritt vor dem Prolinabbau im Vergleich zu HPII im Enzym Prolinoxidase liegt, reichert sich P5C in HPI nicht an. HPI kann daher direkt von HPII durch das Fehlen von P5C und seinen Addukt-Biomarkern in Körperflüssigkeiten unterschieden werden. Der Nachweis von P5C erfordert jedoch eine Derivatisierung für einen genauen Nachweis17,18. Daher kann eine HPII-Diagnose effektiver gestellt werden, bei gleichzeitigem Nachweis von Prolin und den in dieser Arbeit erläuterten Metaboliten 2-OPC und CPC. Der Biomarker 2-OPC unterscheidet jedoch nicht zwischen HPII- und ketotischen Patienten (siehe SI-Abbildung S1). CPC und die beiden HPII-Biomarker 2-Pyrrolylglycin und Pyrrol-2-Carbonsäure unterscheiden dagegen zwischen HPI, HPII und Ketose. Im Hinblick auf die Implikationen unserer Ergebnisse für das pathophysiologische Verständnis von HPII ist es interessant festzustellen, dass für PDE-ALDH7A1 die analogen P6C-Addukt-Biomarker in einem Zebrafisch-Modellsystem ein epileptogenes Potenzial aufweisen und auch im Gehirngewebe von nachgewiesen werden konnten PDE-ALDH7A1-Patienten. Auch wenn dies außerhalb des Rahmens dieser aktuellen Arbeit liegt, sollen zukünftige Studien auch die mögliche direkte Beteiligung der P5C-Addukte an der Ätiologie der Epilepsie bei HPII untersuchen.

Mithilfe von NGMS in Kombination mit IRIS ist es uns gelungen, die molekulare Struktur von Metaboliten, die sich in HPII ansammeln, erfolgreich zu erkennen und zu kommentieren. Die vorläufige Annotation der erkannten Merkmale, basierend auf der Übereinstimmung mit theoretisch vorhergesagten IR-Spektren, die für die Kandidatenstrukturen generiert wurden (postuliert auf der Grundlage sowohl von MS/MS als auch der aus den Infrarotspektren der Merkmale gewonnenen Strukturinformationen), begrenzt die Anzahl synthetischer Standards erforderlich. Mit diesem Ansatz haben wir zwei Sätze diastereomerer Biomarker identifiziert und charakterisiert, die nicht-enzymatisch aus der Reaktion der 1,3-Dicarbonylverbindungen Malon- und Acetessigsäure mit dem sich ansammelnden zyklischen Imin P5C bei HPII-Patienten resultieren. Die Identifizierung der molekularen Strukturen der Biomarker und ihres wahrscheinlichen biochemischen Ursprungs kann zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie der Krankheit und zu einer verbesserten Diagnose von HPII führen.

Für die IRIS-Analyse wurden 1000 µl 0,125 % [v/v] Ameisensäure in 95:5 [v/v] ACN:deionisiertem Wasser zu 100 µl Urin gegeben und mit einem Vortex-Mischer 15 s lang gemischt. Die Proben wurden 20 Minuten lang bei 4 ° C und 18.600 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde in Autosamplerfläschchen überführt und für die HILIC-IRIS-Analyse verwendet. Referenzstandards wurden als 10 µM-Lösungen in ACN/deionisiertem Wasser 95:5 [v/v] analysiert.

Die in dieser Arbeit beschriebenen Körperflüssigkeitsproben stammten von drei HPII-Patienten aus zwei unabhängigen Familien mit dem klassischen klinischen Phänotyp von HPII, einschließlich geistiger Behinderung und Epilepsie. Es wurden drei Proben eines einzelnen HPI-Patienten mit Epilepsie und motorischer Behinderung eingeschlossen. In den Körperflüssigkeiten dieses Patienten wurde wiederholt eine stark erhöhte Prolinkonzentration festgestellt, während die anderen in dieser Arbeit erwähnten HPII nicht erhöht waren. In den HPII-Proben wurde festgestellt, dass Prolin und Hydroxyprolin bei einer speziellen Aminosäureanalyse anstiegen. Der Nachweis für die Anreicherung des HPII-Biomarkers Pyrrol-2-carbonsäure und seines Glycinesters, 2-Pyrrolylglycin, wurde mit NGMS erbracht. Kontrollpersonen und ketotische Patienten in dieser Studie waren im gleichen Altersbereich wie die HPI- und II-Patienten.

NGMS wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt10,16. Kurz gesagt, die Analysen wurden mit einem Agilent 1290 UHPLC in Kombination mit einem Agilent 6545 QTOF-Massenspektrometer durchgeführt. Chromatografische Trennungen wurden auf einer Acquity HSS T3-Säule (C18, 2,1 × 100 mm, 1,8 μm) (Waters) bei 40 °C durchgeführt. Die Analysechargen enthielten Patientenproben, einen Validierungsplasmapool und Proben zur analytischen Qualitätskontrolle (QC), um die Integrität der automatisierten Datenanalysepipeline zu überprüfen.

IRIS-Experimente wurden mit einem Quadrupol-Ionenfallen-Massenspektrometer (Bruker, AmaZon Speed ETD) durchgeführt. Die an diesem Instrument vorgenommenen Hardwaremodifikationen, um IR-Spektroskopie und die Synchronisierung der Ionenfalle mit dem Infrarotlaser zu ermöglichen, werden an anderer Stelle beschrieben19. HILIC-Trennungen wurden unter Verwendung eines Bruker Elute SP HPLC-Systems und einer Waters Acquity-Amidsäule (100 × 2,1 mm ID, 1,7 μm Partikel, 130 Å Porengröße) bei 30 °C durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus 10 mM Ammoniumformiat und 0,125 % [v/v] Ameisensäure in 95:5 [v/v] ACN:deionisiertem Wasser (mobile Phase A) und 50:50 [v/v] ACN:deionisiertes Wasser (mobile Phase B). Es wurde eine Flussrate von 0,5 ml/min und ein Injektionsvolumen von 10 μl verwendet. Die Trennmethode bestand aus einer anfänglichen Zeit von 1 Minute bei 100 % A, gefolgt von einem Gradienten auf 100 % B in 10 Minuten und einem Halten bei 100 % B für 1 Minute. Es wurde eine Äquilibrierungszeit von 8 Minuten verwendet. Fraktionen der Metaboliten wurden mithilfe eines von der Ionenfalle gesteuerten Zwei-Positionen-Schaltventils mit sechs Anschlüssen und einer an diesem Ventil installierten 80-μl-Probenschleife gesammelt. Der größte Teil des HPLC-Eluenten wurde in den Abfall umgeleitet, aber sobald eine Fraktion von Interesse am Ventil ankam, wurde das Ventil umgeschaltet und die Fraktion in der Probenschleife gesammelt. Nach einem weiteren Ventilwechsel wurde die Fraktion zur IRIS-Analyse langsam mit einer Spritzenpumpe (120 μl/h) in die Ionenfalle infundiert.

IR-Spektren wurden mit dem FELIX-Infrarot-Freie-Elektronen-Laser aufgezeichnet, der IR-Strahlung in Form von ∼10 μs Makropulsen von 50–150 mJ bei einer Wiederholungsrate von 10 Hz erzeugte (Bandbreite ∼0,4 % der Mittenfrequenz). Massenisolierte Ionen wurden innerhalb des Ioneneinfangbereichs bestrahlt, wo die resonante Absorption des IR-Lichts durch die Ionen zu einem Anstieg der inneren Energie und nach Erreichen der Dissoziationsschwelle zur Photodissoziation führt. Dies wurde durch die Aufzeichnung eines Fragmentierungsmassenspektrums nach der Bestrahlung an jedem Wellenlängenpunkt beobachtet. Jedes Fragmentierungsspektrum wurde aus 4–8 gemittelten Spektren erstellt. IR-Spektren wurden erstellt, indem die fraktionierte Dissoziation (IR-Ausbeute = ΣI(Fragmentionen)/ΣI(Stamm- + Fragmentionen)) als Funktion der IR-Laserfrequenz aufgetragen wurde. Die IR-Ausbeute wurde linear um frequenzabhängige Schwankungen der Laserpulsenergie20 korrigiert und die IR-Frequenz wurde mit einem Gitterspektrometer kalibriert.

Um die IR-Spektren der Kandidatenstrukturen vorherzusagen, wurden DFT-Berechnungen mit dem Softwarepaket Gaussian1621 durchgeführt. Molekülstrukturen wurden manuell auf der Theorieebene B3LYP/6 − 31 + +G(d,p) definiert und optimiert. Anschließend erfolgte eine Schwingungsfrequenzberechnung im Rahmen der harmonischen Näherung. Die berechneten Spektren wurden mit einem linearen Skalierungsfaktor von 0,975 skaliert und mit einer Gaußschen Linienformfunktion (20 cm−1 Halbwertsbreite) verbreitert, um den Vergleich mit den experimentellen IR-Spektren zu erleichtern.

1H- und 13C-NMR-Spektren wurden mit einem Bruker AVANCE III (500 MHz 1H, 126 MHz 13C), ausgestattet mit einer Bruker Prodigy BB-Kryosonde, oder einem Bruker AVANCE III (400 MHz 1H, 100 MHz 13C) im angegebenen Lösungsmittel bei Raumtemperatur aufgezeichnet. Chemische Verschiebungen werden in δ-Einheiten (ppm) relativ zum Lösungsmittelrestpeak angegeben. Für 1H-NMR-Spektren werden die folgenden Abkürzungen zur Beschreibung von Multiplizitäten verwendet: s (Singulett), d (Dublett), t (Triplett), dd (Doppeldublett) und m (Multiplett). Kopplungskonstanten werden in Hertz (Hz) als J-Wert angegeben.

Alle Lösungsmittel waren analysenrein und wurden bei Bedarf mit Standardmethoden gereinigt und getrocknet. Alle kommerziell erworbenen Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet, wie sie von den entsprechenden Unternehmen geliefert wurden.

Perchlorsäure (9,5 ml, 95 mmol, 60 %) wurde tropfenweise zu einer Suspension von 5-Oxopyrrolidin-2-carbonsäure (30,0 g, 0,39 Mol) in tert.-Butylacetat (220 ml, 1,64 Mol) gegeben und die Mischung wurde in 30 Minuten gerührt 24 Stunden bei RT gerührt. Dann wurde eine weitere Portion Perchlorsäure (9,5 ml, 95 mmol, 60 %) zugegeben und das Rühren 20 Stunden lang fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit festem NaHCO3, verdünnt mit H2O, gequencht und dreimal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Kochsalzlösung gewaschen und über MgSO4 getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft. Das Ergebnis war ein weißer Feststoff mit einer Ausbeute von 46 % (30,5 g, 0,18 Mol). Rf = 0,19 (4:1, EtOAc:Heptan); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 6,26 (s, 1H), 4,18–4,10 (m, 1H), 2,51–2,27 (m, 3H), 2,25–2,12 (m, 1H), 1,49 (s, 9H); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 177,7, 171,0, 82,9, 55,9, 29,3, 28,0, 24,9; HRMS (ESI+): berechnet für C9H15NNaO3 [M + Na]+: 208,0950, gefunden 208,0955.

DMAP (0,66 g, 5,4 mmol) und Boc2O (26 g, 0,12 mol) wurden zu einer Lösung von tert-Butyl-5-oxopyrrolidin-2-carboxylat (20 g, 0,11 mol) in MeCN (180 ml) gegeben. Die Lösung wurde 72 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, der Rückstand in einer EtOAc/CyHex-Mischung (400 ml, 1:1) aufgenommen, über Kieselgel filtriert, zweimal mit EtOAc/Hept (100 ml, 4:1) gewaschen und eingedampft Trockenheit, was einen cremefarbenen Feststoff mit einer Ausbeute von 97 % (30 g, 0,11 Mol) ergab. Rf = 0,68 (4:1, EtOAc:Heptan); 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4,47 (dd, J = 9,5, 2,6 Hz), 2,60 (m), 2,46 (m), 2,28 (ddt, J = 13,4, 10,5, 9,4 Hz), 2,06 – 1,93 (m ), 1,50 (s), 1,48 (s); 13C-NMR (101 MHz, CDCl3) δ 173,5, 170,4, 150,7, 84,0, 82,3, 59,6, 31,2, 28,0, 27,9 und 21,7.

Zu einer Lösung von Di-tert-butyl-5-oxopyrrolidin-1,2-dicarboxylat (3,0 g, 10,5 mmol) in trockenem THF (50 ml) bei −78 °C wurde langsam eine 1 M DIBAL-H-Lösung (21 ml) gegeben , 21 mmol). Nach 3-stündigem Rühren bei −78 °C wurde das überschüssige Reagens durch Zugabe von Isopropanol zerstört. Dann saß. aq. Natrium-Kalium-L-Tartrat (Rochelle-Salz) wurde zugegeben und man ließ die Reaktionsmischung über Nacht langsam auf Raumtemperatur erwärmen. Die Mischung wurde zwischen H2O und EtOAc (5:1) verteilt. Die wässrige Phase wurde noch zweimal mit EtOAc extrahiert. Die gesammelten organischen Schichten wurden über MgSO4 getrocknet und zur Trockne eingeengt. Die Reinigung mittels Säulenchromatographie (0–>60 % EtOAc in Heptan) ergab ein farbloses Öl mit einer Ausbeute von 44,5 % (1,3 g, 4,7 mmol). Rf = 0,35 (1:1 EtOAc:Heptan); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, Diastereomerengemisch) δ 5,65 (dd, J = 6,0, 2,4 Hz, 0,6H), 5,60 (dt, J = 5,5, 2,9 Hz, 0,7H), 5,54 (dd, J = 5,8 , 2,4 Hz, 0,2H), 5,51–5,45 (m, 0,3H), 4,24 (dd, J = 8,8, 1,3 Hz, 0,8H), 4,15 (dd, J = 8,5, 6,7 Hz, 0,7H), 3,57 ( t, J = 2,0 Hz, 0,5H), 3,48 (d, J = 3,4 Hz, 0,7H), 3,12 (d, J = 5,0 Hz, 0,3H), 2,88 (t, J = 2,0 Hz, 0,2H), 2,52–2,41 (m, 0,5H), 2,25 (dtd, J = 13,2, 8,3, 5,0 Hz, 1H), 2,17–2,01 (m, 2H), 2,04–1,83 (m, 2H), 1,74 (s, 3H) , 1,48–1,45 (m, 18H), 1,34–1,24 (m, 1H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3, Diastereoisomerengemisch) δ 172,2, 171,6, 154,4, 154,0, 123,0, 129,7, 128,4, 82,6, 82,32, 82,29, 81,3, 81,1, 80,78, 80,75 , 60,04, 59,95, 59,91, 33,6, 32,2 , 31,7, 30,9, 28,5, 28,4, 28,29, 28,28, 28,0, 27,94, 27,89, 27,1 und 26,9.

Di-tert-butyl (2 S)-5-hydroxypyrrolidin-1,2-dicarboxylat (750 mg, 2,6 mmol) wurde in Dioxan (10 ml) gelöst und mit HCl (20 ml, 6 molar) versetzt und 1 Stunde lang gerührt H. Die Reaktionsmischung wurde im Vakuum eingeengt und unverändert verwendet.

Eine Lösung von Malonsäure (108 mg) in H2O (5 ml) wurde mit festem NaOH auf pH 7 neutralisiert. Zu dieser Lösung wurde die Mischung aus P5C.HCl (390 mg, 2,6 mmol) gegeben, während der pH-Wert durch Zugabe von NaOH (2 M) zwischen 6 und 7 gehalten wurde. Nachdem die Lösung (endgültiger pH-Wert = 6,5) 4 Tage lang gerührt wurde, wurde sie auf pH = 1 angesäuert, 30 Minuten lang unter Rückfluss erhitzt und anschließend im Vakuum konzentriert. Der resultierende Rückstand wurde in DMF (10 ml) erneut gelöst und auf 0 °C abgekühlt. Festes K2CO3 (717 mg, 5,2 mmol) wurde zugegeben, gefolgt von der Zugabe von BnBr (0,61 ml, 5,1 mmol). Die resultierende Mischung wurde über Nacht gerührt und mit weiterem BnBr (0,2 ml, 2,0 mmol) und K2CO3 (190 mg, 1,37 mmol) versetzt und die Lösung weitere 4 Stunden gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum konzentriert, der Rückstand wurde in EtOAc (10 ml) aufgenommen, mit H2O (5 ml) und Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (30 % EtOAc in Heptan), gefolgt von (5 % Et2O in Toluol), führte zur Trennung der Diastereomere, die in einer Ausbeute von 12 % für cis (128,6 mg, 0,29 mmol) und 10 % für trans erhalten wurden (115,5 mg, 0,26 mmol). Cis: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,41 – 7,29 (m, 8H), 7,33 – 7,24 (m, 5H), 7,27 – 7,16 (m, 2H), 5,10 (s, 2H), 5,01 – 4,90 (m , 2H), 3,92 (d, J = 13,9 Hz), 3,78 (d, J = 13,9 Hz), 3,49 – 3,41 (m, 1H), 3,32 – 3,23 (m, 1H), 2,68 (dd, J = 15,2, 4,4 Hz), 2,44 (dd, J = 15,2, 8,9 Hz), 2,09–1,86 (m, 3H), 1,78–1,65 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 174,2, 172,0, 138,3, 136,0, 129,2, 128,53, 128,48, 128,2, 128,14, 128,10, 128,09, 127,1, 66,19, 66,16, 66,1, 62,5, 61,3, 57,7, 40,5, 30,8, 28,4 ; MS (ESI+): berechnet für C28H30NO4 [M + H]+: 444,22, gefunden 444,24. Trans: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,42 – 7,28 (m, 10H), 7,27 – 7,16 (m, 5H), 5,23 – 5,02 (m, 4H), 3,95 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 3,77 – 3,67 (m, 2H), 3,61 (dd, J = 8,2, 1,6 Hz, 1H), 2,68 (dd, J = 14,6, 3,9 Hz, 1H), 2,40 (dd, J = 14,6, 8,7 Hz, 1) , 2,33 – 2,21 (m, 1H), 2,15 – 2,03 (m, 1H), 1,85 – 1,74 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 173,5, 171,4, 139,2, 136,0, 128,58, 128,55, 128,5, 128,33, 128,27, 128,25, 128,22, 128,21, 127,0, 66,2 , 65,9, 62,9, 58,6, 52,7, 39,8, 29,4, 27,7 ; MS (ESI+): berechnet für C28H30NO4 [M + H]+: 444,22, gefunden 444,24.

Eine Lösung von frisch hergestellter Acetoessigsäure (750 mg) durch quantitative saure Entschützung von tert-Butylacetoacetat in H2O wurde mit NaOH auf pH 7 neutralisiert. Zu dieser Lösung wurde frisch zubereitetes P5C (214 mg, 1,43 mmol) gegeben, wobei der pH-Wert bei gleichzeitiger Zugabe von 1 M NaOH zwischen 6 und 7 gehalten wurde. Die Mischung wurde 2 Tage lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, mit 1 M HCl auf pH = 1 angesäuert und 30 Minuten lang zum Rückfluss gebracht. Die Mischung wurde im Vakuum eingeengt, gefolgt von der Entfernung der Salze durch Heißfiltration aus Ethanol. Das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert und in DMF (10 ml) gelöst. Festes K2CO3 (1,2 g, 8,6 mmol) sowie BnBr (0,85 ml, 7,2 mmol) wurden zugegeben und die Reaktionsmischung über Nacht gerührt. Die Mischung wurde im Vakuum konzentriert, der Rückstand wurde in EtOAc aufgenommen und die organische Schicht wurde dreimal mit H2O und Kochsalzlösung gewaschen, über MgSO4 getrocknet und im Vakuum konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (5 % Et2O in Toluol) führte zur Isolierung nur des cis-Stereoisomers als ausreichend reines Produkt, das als weißer Feststoff in einer Ausbeute von 6 % (32,5 mg, 92 µmol) erhalten wurde. Rf = 0,6 (1:1 EtOAc:Heptan); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,43 – 7,17 (m, 10H), 5,07 – 4,90 (m, 2H), 3,92 – 3,74 (m, 2H), 3,44 (dd, J = 7,9, 6,4 Hz, 1H), 3,33 – 3,24 (m, 1H), 2,70 (dd, J = 16,7, 4,4 Hz, 1H), 2,50 (dd, J = 16,6, 8,3 Hz, 1H), 2,13 – 2,01 (m, 5H), 1,98 – 1,88 ( m, 1H), 1,64 – 1,56 (m, 1H); 13C NMR (126 MHz, CDCl3) δ 208,4, 174,4, 138,7, 136,0, 129,3, 128,6, 128,26, 128,24, 127,2, 66,32, 66,28, 60,8, 58,2, 49,6, 31,04 , 30,97 und 28,6.

Eine Lösung der benzylierten Verbindung (1,0 Äquiv.) in Methanol (40 mM) wurde mit Inertgas gespült, 10 % Pd/C (10 Mol-%) zugegeben und die Atmosphäre gegen H2 ausgetauscht. Die Suspension wurde 20 Stunden lang bei Raumtemperatur unter einer H2-Atmosphäre gerührt. Der Kolben wurde evakuiert und mit Stickstoff gespült und die Mischung wurde durch Celite filtriert und mit 50 ml Methanol gespült. Das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt und lyophilisiert.

Benzyl(2 s,5r)-1-benzyl-5-(2-(benzyloxy)-2-oxoethyl)pyrrolidin-2-carboxylat (95 mg, 210 μmol) wurde gemäß Verfahren A hydriert, was zu einem flockigen weißen Feststoff führte in quantitativer Ausbeute (24 mg, 138 μmol) nach Lyophilisierung. 1H-NMR (500 MHz, D2O) δ 4,12 (dd, J = 9,3, 4,7 Hz, 1H), 3,89 (ddd, J = 11,9, 8,6, 6,0 Hz, 1H), 2,91 – 2,75 (m, 2H), 2,28 ( m, 1H), 2,22 – 2,08 (m, 2H), 1,72 – 1,60 (m, 1H); 13C-NMR (126 MHz, D2O) δ 175,0, 174,4, 61,2, 57,2, 36,2, 28,8, 28,1; HRMS (ESI+): berechnet für C7H12NO4 [M + H]+ 174,0761, gefunden 174,0765.

Benzyl(2 s,5 s)-1-benzyl-5-(2-(benzyloxy)-2-oxoethyl)pyrrolidin-2-carboxylat (128,6 mg, 289,9 μmol) wurde gemäß Verfahren A hydriert, was zu einem flockigen Weiß führte Feststoff in 65 % Ausbeute (49 mg, 138 μmol) nach der Lyophilisierung, der nach der Lyophilisierung eine geringe aromatische Verunreinigung enthielt (<10 % basierend auf NMR). 1H-NMR (500 MHz, D2O) δ 4,07 (t, J = 8,3 Hz, 1H), 3,83 (dq, J = 9,5, 6,5 Hz, 1H), 2,62 – 2,49 (m, 2H), 2,38 (dtd, J = 12,9, 8,1, 3,6 Hz, 1H), 2,14 (dtd, J = 13,5, 6,9, 3,7 Hz, 1H), 1,94 (ddt, J = 13,1, 9,7, 7,8 Hz, 1H), 1,67 (dtd, J = 13,1, 9,5, 7,7 Hz, 1H); 13C-NMR (126 MHz, D2O) δ 178,1, 175,3, 138,9, 60,7, 57,8, 38,2, 30,0 und 28,6; HRMS (ESI+): berechnet für C7H12NO4 [M + H]+: 174,0761, gefunden 174,0765.

Benzyl (2 s,5r)-1-benzyl-5-(2-oxopropyl)pyrrolidin-2-carboxylat (30 mg, 85 μmol) wurde gemäß Verfahren A hydriert, wobei MeOH durch MeCN ersetzt wurde. Dies führte zu einem flockigen weißen Feststoff, der in quantitativer Ausbeute (15 mg, 85 μmol) erhalten wurde. 1H-NMR (500 MHz, D2O) δ 4,09 (dd, J = 9,5, 4,2 Hz, 1H), 3,88 (tt, J = 10,0, 5,6 Hz, 1H), 3,14 (dd, J = 19,2, 4,3 Hz, 1H) , 3,05 (dd, J = 19,2, 9,0 Hz, 1H), 2,27 – 2,20 (m, 1H), 2,18 (d, J = 0,6 Hz, 3H), 2,13 (tdd, J = 9,7, 6,6, 3,5 Hz, 2H ), 1,66 – 1,57 (m, 1H); 13C-NMR (126 MHz, D2O) δ 210,9 (HMBC), 61,3, 56,2, 44,6, 29,1, 28,7 und 28,2; LC-HRMS (ESI+): berechnet für C8H14NO3 [M + H]+: 172,0968, gefunden 172,0964.

Di-tert-butyl (2 s)-5-hydroxypyrrolidin-1,2-dicarboxylat (105,5 mg, 367,1 μmol) wurde in Methanol (5 ml) und einer katalytischen Menge p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (3,3 mg, 17 μmol) gelöst. wurde langsam hinzugefügt. Die Reaktion wurde 48 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit EtOAc (20 ml) verdünnt. Die organische Schicht wurde dreimal mit gesättigter wässriger NaHCO3 gewaschen und über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Rf = 0,45 (3:7 EtOAc:Heptan), 1H-NMR (400 MHz, CDCl3, Diastereoisomere, Signal von tert-Butyl eingestellt als 18) δ 5,31 (dd, J = 11,2, 4,6 Hz, 0,6H), 5,20 (d , J = 4,7 Hz, 0,2H), 5,15 (d, J = 4,9 Hz, 0,2H), 4,27 – 4,09 (m, 1H), 3,45 (s, 1H), 3,42 (s, 1,4H), 3,37 (s , 0,4H), 2,50 – 2,24 (m, 0,7H), 2,21 – 2,07 (m, 0,2H), 2,01 – 1,81 (m, 1,5H), 1,61 (s, 1,8H), 1,55 – 1,44 (m, 18H ); 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 202,3, 171,8, 89,37, 89,33, 88,5, 81,0, 80,4, 60,4, 60,0, 59,9, 56,2, 55,8, 55,3, 32,3, 31,1, 29,9, 28 .32, 28,25, 28,03, 28,01, 27,98 , 27,91 und 27,1; HRMS (ESI+): Berechnet. für C15H27NNaO5 [M + Na]+: 324,1781, gefunden 324,1787.

Zu einer Lösung von Di-tert-butyl (2 s)-5-methoxypyrrolidin-1,2-dicarboxylat (106,5 mg, 353,4 μmol) in trockenem Acetonitril (10 ml) wird tert-Butyldimethyl(prop-1-en-2- Yyloxysilan (118,2 mg, 685,9 μmol) wurde zugegeben und die Mischung auf −30 °C abgekühlt. Zinn(II)-trifluormethansulfonat (75,1 mg, 180 μmol) wurde zugegeben und die Mischung 72 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit EtOAc (10 ml) verdünnt und mit gesättiger Lösung gequencht. aq. NaHCO3 (5 ml). Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde über MgSO4 getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck eingedampft. Der resultierende Rückstand wurde durch Säulenchromatographie (0 → 30 % EtOAc in Heptan) gereinigt, was eine Ausbeute von 25 % (89,1 μmol, 29,2 mg) ergab. Rf = 0,36 (3:7 EtOAc:Heptan); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3, Diastereomere, Signal von tert-Butyl eingestellt als 18): δ 4,43 – 4,35 (m, 0,4H), 4,35 – 4,18 (m, 0,7H), 4,18 – 4,11 (m, 0,8H) , 3,39 (dd, J = 17,1, 3,4 Hz, 0,5H), 3,16 (dd, J = 16,0, 3,4 Hz, 0,5H), 2,96 (dd, J = 16,0, 3,0 Hz, 0,3H), 2,65 (dd, J = 16,9, 9,7 Hz, 0,3H), 2,55 (dd, J = 17,1, 10,0 Hz, 0,5H), 2,41 (td, J = 15,9, 15,4, 10,1 Hz, 0,5H), 2,18 (s, 5H), 1,96 – 1,87 (m, 0,6H), 1,72 – 1,63 (m, 1H), 1,52 – 1,43 (m, 18H); 13C-NMR (126 MHz, CDCl3, Diastereomere) δ 207,6, 172,0, 60,5, 54,5, 54,2, 47,8, 30,0, 28,8 28,44, 28,37, 28,33, 28,03 und 28,01; HRMS (ESI+): berechnet für C17H29NNaO5 [M + Na]+: 350,1943, gefunden 350,1942.

Di-tert-butyl (2 s,5)-5-(2-oxopropyl)pyrrolidin-1,2-dicarboxylat (20 mg, 61 μmol) wurde in einer Mischung aus TFA:H2O:TIS (10 ml, 50: 45:5). Nach 1 Stunde wurde das Lösungsmittel abgedampft und das verbleibende TFA zweimal in Gegenwart von Toluol abgedampft und der Rückstand anschließend lyophilisiert, um die braune wachsartige Substanz in einer Ausbeute von 92 % (56,5 μmol, 15,2 mg) zu erhalten. Rf = 0,05 (1:10 MeOH:DCM); 1H-NMR (400 MHz, D2O, Diastereomere) δ 4,35 – 4,25 (m, 1H), 4,05 – 3,85 (m, 1H), 3,21 – 2,91 (m, 2H), 2,57– 2,22 (m, 5H), 2,21 – 2,06 (m, 0,5H), 1,88 – 1,67 (m, 1H). 13C NMR (101 MHz, D2O, Diastereomere) δ 210,8, 210,7, 172,7, 90,5, 60,2, 59,7, 56,3, 55,9, 44,4, 44,2, 29,4, 29,09, 29,07, 28,5, 27,7, 2 7,6; HRMS (ESI+): berechnet für C8H13NO3 [M + H]+: 172,0968, gefunden 172,0974.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Ergänzende Abbildungen und NMR-Spektren sind in der Datei „Ergänzende Informationen“ verfügbar. Daten, die den präsentierten MS/MS-Spektren zugrunde liegen, sind in den Zusatzdaten 1 verfügbar. Daten, die den experimentellen IR-Spektren zugrunde liegen, sind in den Zusatzdaten 2 verfügbar. Daten, die den theoretischen IR-Spektren und Koordinaten der quantenchemisch optimierten Strukturen zugrunde liegen, die in der ergänzenden Abbildung S8 dargestellt sind, sind verfügbar in Supplementary Data 3. Daten, die der relativen Häufigkeit von m/z 172,0968 in Abb. S1 zugrunde liegen, sind in Supplementary Data 4 verfügbar. Daten, die den HPLC-Spuren in Abb. S1 zugrunde liegen. S2–7 und S9 sind in Supplementary Data 5 verfügbar. Rohe Forschungsdatendateien werden lokal auf Datenservern archiviert und sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren ([email protected], [email protected]) erhältlich.

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Teile dieser Arbeit wurden durch ein Interfaculty Collaboration Grant der Radboud University Nijmegen (an KLMC, RAW, JO und J.Ma) finanziell unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch ein ERC-Stg-Stipendium (GlycoEdit, 758913) unterstützt, das an TJB vergeben wurde. Diese Forschung wurde teilweise durch ein Stimuleringsbeurs der Society for Inborn Errors of Metabolism for Netherlands and Belgium (ESN) finanziert, ein Katalysatorstipendium von United für Stoffwechselerkrankungen (UMD-CG-2020-004) und ein Stofwisselkracht-Stipendium unter dem Projektnamen „Innovative Diagnostik in der Cerebrospinalflüssigkeit von Patienten mit neurometabolischen Störungen“ (alle an KLMC). Die Autoren danken außerdem dem Dutch Research Council (NWO) Domain Science für die Unterstützung des FELIX-Labors und gewähren TTW 15769, TKI-LIFT 731.017.419 und Rekentijd 2021.055 (alle an JO). Wir danken Siebolt de Boer, Joris Reintjes und Ed van der Heeft für die technische Unterstützung. Diese Forschung nutzte die Metabolomics-Infrastruktur, die Teil der von der NWO finanzierten niederländischen X-Omics-Initiative, Projekt 184.034.019, ist.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jona Merx, Rianne E. van Outersterp, Udo FH Engelke.

Radboud-Universität, Institut für Moleküle und Materialien, synthetische organische Chemie, Heyendaalseweg 135, 6525 AJ, Nijmegen, Niederlande

Jona Merx, Veronique Hendriks, Floris PJT Rutjes & Thomas J. Boltje

Radboud-Universität, Institut für Moleküle und Materialien, FELIX-Labor, Toernooiveld 7, 6525 ED, Nijmegen, Niederlande

Rianne E. van Outersterp, Jos Oomens und Jonathan Martens

Abteilung für Labormedizin, Translational Metabolic Laboratory, Radboud University Medical Center, Geert Grooteplein Zuid 10, 6525 GA, Nijmegen, Niederlande

Udo FH Engelke, Ron A. Wevers, Marleen CDG Huigen & Karlien LM Coene

United for Metabolic Disease, UMD, Amsterdam, Niederlande

Ron A. Wevers, Marleen CDG Huigen, Irene MLW Körver-Keularts und Karlien LM Coene

Abteilung für klinische Genetik, Universitätsklinikum Maastricht, Maastricht, Niederlande

Huub WAH Waterval & Irene MLW Körver-Keularts

Fachbereich Physik, Chemie und Pharmazie, Universität Süddänemark, Campusvej 55, 5230, Odense, Dänemark

Jasmin Mecinović

Abteilung für Klinische Chemie und Hämatologie, Elisabeth-TweeSteden-Krankenhaus, Tilburg, Niederlande

Karlien LM Coene

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J.Mer, REvO und UFHE haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen und teilen sich die Erstautorenschaft. J.Ma, RAW und TJB konzipierten und überwachten die Studie. IRIS-Messungen, Datenanalysen und quantenchemische Berechnungen wurden von REvO unter der Leitung von J.Ma durchgeführt und JOUFHE führte LC-MS-Experimente unter der Aufsicht von KLMC und RAWIMLWK-K. durch, und HWAHW stellte HPII-Körperflüssigkeiten zur Verfügung. Die Synthese von Referenzstandards in Nijmegen wurde von J.Mer entworfen und von J.Mer und VH unter der Aufsicht von TJB, J.Mec und FPJTR durchgeführt. Biochemische und klinische Aspekte dieser Studie wurden von KLMC, MCDGH und RAW beigesteuert. Der Auftrag Die Anzahl der gemeinsamen Erstautoren UFHE, REvO und J.Mer wurde einvernehmlich festgelegt, wobei J.Mer der erste gelistete Autor war, der die hauptsächlich biochemischen Auswirkungen widerspiegelte. Der Manuskriptentwurf wurde von J.Mer und REvO verfasst und zu medizinischen Aspekten von KLMC. Das Manuskript wurde dann von JO, TJB, RAW und J.Ma mit Hilfe aller Autoren bearbeitet. Der Erwerb der Hauptzuschüsse, auf denen diese Studie basiert, erfolgte durch JO, TJB, KLMC und J.Ma.

Korrespondenz mit Jonathan Martens oder Thomas J. Boltje.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Die in dieser Studie beschriebenen Arbeiten wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Erklärung von Helsinki) für Experimente mit Menschen durchgeführt. Alle Patienten (oder ihre Erziehungsberechtigten) stimmten der möglichen Verwendung ihrer anonymisierten Restproben für Methodenvalidierungszwecke in Übereinstimmung mit der institutionellen und nationalen Gesetzgebung zu.

Communications Biology dankt Arthur Cooper und Déborah Mathis für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Merx, J., van Outersterp, RE, Engelke, UFH et al. Identifizierung von aus Δ-1-Pyrrolin-5-carboxylat abgeleiteten Biomarkern für Hyperprolinämie Typ II. Commun Biol 5, 997 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03960-2

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Eingegangen: 06. April 2022

Angenommen: 07. September 2022

Veröffentlicht: 21. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03960-2

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